Mioglobina y vejez muscular

lleri/ abril 20, 2019/ 1.- Medicina Tradicional China MTC/ 0 comentarios

La mioglobinopatía es una miopatía autosómica dominante de aparición adulta con inclusiones sarcoplasmicas características

La mioglobina, codificada por MB, es una Hemoproteína globular pequeña y citoplasmática muy expresada en miocitos cardíacos y miofibras esqueléticas oxidativas. La mioglobina se une al O2, facilita su transporte intracelular y sirve como controlador de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno. Aquí, identificamos una sustitución recurrente de c. 292C > T (p. His98Tyr) en MB en catorce miembros de seis familias europeas que sufren de una miopatía progresiva autosómica dominante con inclusiones sarcoplasmicas altamente características en el músculo esquelético y cardíaco. La mioglobinopatía se manifiesta en la adultez con debilidad proximal y axial que progresa para involucrar a los músculos distales y causa insuficiencia respiratoria y cardíaca. La caracterización bioquímica revela que la mioglobina mutada ha alterado la Unión a O2, exhibe una tasa de disociación del hemo más rápido y tiene un menor potencial de reducción comparado con la mioglobina silvestre. Los estudios preliminares demuestran que la mioglobina mutante puede dar lugar a niveles elevados de superóxido a nivel celular. Estos datos definen una enfermedad muscular reconocible asociada con la mutación de MB.

Introducción

La mioglobina, el pigmento que le da al músculo su color rojo, es una pequeña Hemoproteína globular citoplásmica altamente expresada en músculo esquelético cardíaco y oxidativo fibers1.

Mediante la Unión reversible de O2, myoglobina buffers intracelulares O2concentrations, facilita el transporte intracelular de O2 y sirve como un reservorio de oxígeno durante el hipoxico y el anoxico Conditions1, 2, 3. Además, la mioglobina está implicada in vivo en el control de las vías redox en los miocitos esqueléticos y cardíacos, actuando como carroñero de especies de oxígeno reactivo (ROS) y nítrico oxide4, 5.

La mioglobina fue la primera proteína para la cual una estructura tridimensional fue determinada por X-Ray crystallography6. La columna vertebral de la mioglobina consiste en ocho α-hélices, asignadas las letras a a H, que envuelven alrededor de un bolsillo central que contiene un grupo de hemo, un anillo de porfirina que contiene un átomo de hierro Unido central que normalmente está en el estado de oxidación ferroso. Su sitio activo hemo es responsable de la Unión reversible a varios ligandos, incluyendo oxígeno, monóxido de carbono y oxide7 nítrico.

La mioglobina está codificada por el gen de mioglobina (MB) en el cromosoma 12.37 humano 22q.

Aquí describimos la mioglobinopatía, una enfermedad causada por una Mbmutación recurrente que se encuentra en 14 pacientes de seis familias europeas no relacionadas que sufren de una miopatía autosómica dominante con afectación cardíaca variable y inclusiones sarcoplasmicas características en el músculo esquelético y cardíaco. Mostramos que la mutación de MB altera la cinética y la termodinámica de la Unión a O2 y puede dar lugar a niveles elevados de superóxido.

Resultados

El fenotipo clínico de la mioglobinopatía

Estudiamos 14 pacientes de seis familias europeas no relacionadas (F1 – F6), (Fig. 1), que sufren de una miopatía autosómica dominante con afectación cardíaca variable, identificada por sus rasgos altamente característicos en las biopsias musculares. La presentación clínica fue homogénea entre todos los pacientes y se resume en la tabla 1. La edad de aparición osciló entre 33 y 49 años. Los síntomas iniciales fueron las extremidades inferiores proximales, la faja pélvica y la debilidad muscular axial, manifestándose con dificultades subiendo escaleras, subiendo de la posición en cuestas y de pie desde la postura de mentira. Dos pacientes tuvieron, además, debilidad y atrofia de los músculos del thenar desde el inicio de la enfermedad. Durante los años siguientes, la enfermedad progresó lentamente para involucrar a los músculos distales de las piernas y las manos, los músculos proximales de las extremidades superiores y los músculos del cuello. Cinco pacientes se quejaron de disfagia. Los músculos faciales y extraoculares no estaban involucrados. La progresión fue lenta; la mayoría de los pacientes desarrollaron insuficiencia respiratoria que requiere soporte ventilatorio nocturno no invasivo 10 años después de la aparición de la enfermedad y se convirtieron en silla de ruedas 15 – 20 años después del inicio de la enfermedad. Se observó afectación cardíaca, revelada por ultrasonido, resonancia magnética (RM) o examen de miocardium post mortem, en seis individuos. La resonancia magnética cardíaca en el paciente F2, II: 2 mostró una miocardiopatía dilatada con áreas extensas y difusas de mejora tardía del gadolinio, indicativo de fibrosis en el epicardio y mesocardium, pero sin afectación del endocardio, (Fig. 1 complementario). Seis pacientes murieron entre 18 y 30 años después de la aparición de la enfermedad, por insuficiencia respiratoria y/o cardíaca.

Fig. 1
Fig. 1

Tabla 1 características Fenotíricas de la tabla Mioglobinopatyfull tamaño

Los niveles séricos de CK fueron normales y ligeramente aumentados, excepto para una sola persona que mostró niveles de CK hasta séptuple por encima del límite normal superior. La EMG fue consistente con una miopatía con actividad espontánea en reposo. Los estudios de conducción nerviosa fueron normales. Estudios de imágenes musculares mostraron un patrón consistente caracterizado por cambios degenerativos grasos en los músculos paraspinales y gluteales, especialmente glúteos Maximus y medius. En la mitad del muslo, hubo afectación preferencial del aductor Magnus, semimembranosus, cabeza larga de bíceps femoral y vasto intermedius, excepto en F6 individuales, II: 4 que mostraron una afectación predominante del compartimento anterior. En la media pierna, el Soleus Air fue siempre el primer y más afectado músculo (Fig. 2).

Fig. 2
Fig. 2

Las características de patología muscular asociadas con la mutación MB

Las biopsias musculares mostraron cuerpos sarcoplasmáticos característicos en miofibras tipo 1 y tipo 2 en todos los pacientes estudiados, incluyendo individuos pre-sintomáticos, independientemente del sitio de la biopsia (Fig. 3Y tabla complementaria 1). Los cuerpos sarcoplasmáticos eran redondos u ovalados, aparecieron marrones en la hematoxilina y la eosina y rojo en la mancha tricroma modificada de Gomori. Tenían un aspecto vidrioso y se visualizaban fácilmente con todas las manchas e incluso en secciones no teñidas.

Fig. 3
Fig. 3

Exhibieron la emisión de Autofluorescencia en una amplia gama de líneas de excitación láser visibles (Fig. 2 complementario). Además de los cuerpos sarcoplásmicos, la mayoría de las biopsias musculares mostraron cambios miopáticos no específicos con una mayor variación del tamaño de miofibras, un mayor número de núcleos internos y predominancia de fibra tipo 1 (tabla complementaria 1). La mayoría de las biopsias musculares, en particular las que muestran lesiones patológicas avanzadas, mostraron vacuolas citoplásmicas llenas de material basófilo granular, mostrando una fuerte actividad de fosfatasa ácida y proteína de membrana asociada a lisosomía 1 (LAMP1) inmunoreactividad (Fig. 3), indicando que contenían lisosomas. No se observaron cambios arquitectónicos importantes en las reacciones de NADH, SDH y COX, aparte de la falta de actividad oxidativa en el sitio de las vacuolas. Se observó inmunoreactividad de mioglobina, P62 y ubiquitina en regiones anormales de miofibras que contenían vacuolas y en algunos cuerpos sarcoplásmicos, pero no en todos (Fig. 4), demostrando una agregación anormal de proteínas (Fig. 4). Sin embargo, el inmunostamiento de mioglobina no fue particularmente útil para el diagnóstico. En microscopía electrónica, las inclusiones aparecieron como cuerpos muy densos que miden 0,3 a 2,5 μm, a menudo situados junto a myonuclelei o dispersos entre miofibrillas (Fig. 5A – d e Fig. 5E – g). Algunos estaban ligados a la membrana, mientras que otros no. Algunos eran más densos que otros, probablemente reflejando diferentes etapas del proceso patológico. Las vacuolas autofágicas con desechos celulares, figuras de mielina y filamentos que miden 8 – 12 Nm fueron hallazgos adicionales. Los cuerpos sarcoplásmicos estuvieron presentes en los músculos respiratorios y cardíacos obtenidos post mortem a partir de la F1 individual, II: 7 y en el músculo cardíaco de F3 individual, III: 5 (Fig. 5D y la Fig. 3 complementaria), lo que indica que la miocardiopatía fue una consecuencia primordial de la enfermedad y no es secundaria a la insuficiencia respiratoria.

Fig. 4
Fig. 4
Fig. 5
Fig. 5

Identificación de la sustitución de p. His98Tyr MB en seis familias

Para identificar la causa molecular de esta Miopatía, dos grupos independientes utilizaron dos estrategias diferentes. El grupo australiano utilizó la secuenciación completa de tres individuos afectados de dos familias españolas (F1, II: 5 y II: 7 y F2, II: 2), y la priorización génica de variantes compartidas utilizando datos de enriquecimiento de la expresión muscular esquelética de FANTOM58. Esto identificó la misma variante de mal sentido heterocigótico (c. 292C > T, p. His98Tyr) en el gen de mioglobina (MB) en los tres individuos afectados. El grupo sueco, estudiando la familia F3, identificó una región en el cromosoma 22 a través del análisis de vinculación en todo el genoma, con una puntuación de LOD estadísticamente significativa. El refinamiento del pico con más marcadores y clarificación del estado de la enfermedad en los miembros de la familia, dio como resultado una puntuación de LOD multipunto máxima de 5,8 en D22S685 (Fig. 4 suplementario). Captura selectiva y secuenciación de genes dentro de la región de vinculación en ocho individuos, seis afectados y dos no afectados, revelado en todos los miembros de la familia afectados, la presencia de la misma MB (c. 292C > T, p. His98Tyr) variante. La secuenciación de Sanger confirmó la segregación de la variante con la enfermedad en todos los miembros de la familia disponibles y en tres familias adicionales (F4, F5 y F6). La variante implica un residuo altamente conservado en la proximidad del grupo hemo de enlace de oxígeno (Fig. 5 complementario), está ausente en todos los parientes no afectados probados, no está presente en los conjuntos de datos 1000genomes, ExAC (http://exac.broadinstitute.org/) o gnomAD ((http://gnomad.broadinstitute.org) y estaba presente en diferentes haplotipos. Por otra parte, todos los predictores in silico sugieren que la sustitución observada en MB es perjudicial: MutationAssessor (impacto funcional medio, FI score 3,175), MutationTaster (causante de la enfermedad, p = 0.999), PolyPhen-2 (probablemente perjudicial, score 1,000), provean ( deletérea, score − 4,093) y SIFT (dañino, score 0,001). Por lo tanto, tenemos pruebas convincentes en seis familias de que la misma variante MB (c. 292C > T, p. His98Tyr) es responsable de la miopatía observada.

El análisis de haplotipo usando microsatélites dentro de 3 MBP del gen MB indicaba al menos tres haplotipos diferentes dentro de las seis familias, sugiriendo que la variante c. 292C > T es una variante recurrente originaria de diferentes orígenes ancestrales ( Tabla complementaria 2). Además, el análisis de haplotipos en la familia F5 demostró que los hermanos afectados y dos no afectados tenían alelos idénticos, lo que sugiere que en el individuo afectado la variante probablemente surgió de novo (tabla complementaria 2). No hay muestras de los padres en la familia F5 estaban disponibles para su confirmación.

Los ratones nocaut de mioglobina tienen un fenotipo binario. Dos tercios mueren en el útero en ~ E 9.5E 10.59, pero los que sobreviven viven a la adultez con poco signo de efectos funcionales, debido a múltiples mechanisms10 compensatorias. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de una ganancia dominante de la función como la causa de la enfermedad en las familias y se utilizaron múltiples métodos para investigar el pathomechanismo.

El análisis de NanoSIMS de los cuerpos sarcoplasmáticos

La microscopía electrónica correlativa y los NanoSIMS (espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala) revelaron un alto contenido de azufre y pequeñas señales de hierro en los cuerpos sarcoplásmicos (Fig. 5h – j). De la nota, el azufre es un componente de los sistemas antioxidantes de las células y las especies reactivas de azufre se forman en condiciones de stress11 oxidativo, 12. Las señales de hierro podrían estar relacionadas con la degradación de la mioglobina y otras metaloproteínas dentro del lysosomes13. Análisis comparativo de NanoSIMS de muestras de mioglobinopatía con una muestra de un paciente con enfermedad de Pompe que contiene inclusiones densas en electrones, dos muestras que muestran abundante lipofuscina y dos muestras musculares de pacientes afectados con miopatías distales con vacuolas rellenas, reveló que la cantidad de fe es mayor en los cuerpos sarcoplásmicos de la mioglobinopatía que en otras inclusiones similares.

Análisis μFTIR de muestras de biopsia muscular

El análisis de microscopía infrarroja de transformada de Fourier (μftir) de muestras musculares demostró un aumento de los grupos de carbonilo (éster) en los cuerpos sarcoplásmicos que indican oxidación lipídica (Fig. 5K – m). Por otra parte, algunos cuerpos sarcoplasmáticos mostraron una banda de 1627 cm − 1, que es característico de la hoja intermoleculares β-structures14 (Fig. 5N) y una característica típica de la amiloide formation15, 16. Sin embargo, in vitro, solo se detectaron pequeñas cantidades de estructura β-amiloide no fibrilar (ver nota complementaria 1 y Fig. 6 complementaria). Los agregados de hojas β no fibrilares se han descrito previamente para otros péptidos y proteínas, incluidos los péptidos β-amiloides relacionados con la enfermedad de Alzheimer disease16. Tanto NanoSIMS como μFTIR, por lo tanto, sugieren que la oxidación lipídica en los músculos de los pacientes contribuye a la formación del cuerpo Sarcoplasmático.

La caracterización bioquímica

A nivel molecular, la variante His98Tyr podría impactar en diferentes propiedades funcionales de MB, cruciales para el papel fisiológico: Estos incluyen la interacción de MB con dioxígeno, la afinidad de la proteína MB de andamio a la hemina, así como la capacidad de mantener el hemo en estado reducido (FE2 +). In vivo, el MB ferroso (FE2 +), que es la única forma de mioglobina que puede enlazar y almacenar O2, es propenso a autoxidation17, lo que lleva a MetMB funcionalmente inactivos (FE3 +), que finalmente se reduce a MB ferrosos por el citocromo b518, 19.

En primer lugar, evaluamos si la variante afecta a la afinidad del grupo protésico de la matriz polipeptídica MB, ya que se ha demostrado que las mutaciones en las proximidades del anillo de porfirina pueden aumentar las tasas de disociación del hemo (k-H) por dos órdenes de magnitude20, 21, 22. A pH 7,0, el k-H de H98Y fue cinco veces mayor comparado con el WT (tabla 2 y la Fig. 7 complementaria). Las mutaciones del residuo correspondiente (His97) en la mioglobina de los cachalotes en los aminoácidos pequeños e hidrófobos (p. ej., ala, Val) o ácidos (p. ej., Glu, ASP) mejoraron k-H21, 22 debido a la pérdida de interacción electrostática entre la cadena lateral de His97 y el cargado negativamente propionato de hemo-721. His98 de MB humanos contribuye a modular la accesibilidad del solvente al bolsillo del hemo. Tras el intercambio de His98 con Tyr, la interacción con el propionato se debilita; Tyr98 todavía puede formar enlaces H con propionato-7, sin embargo, k-H es más alto para p. His98Tyr en comparación con WT MB. En particular, este cambio en k-H está en línea con el mutante His97Phe de cachalote myoglobin21, 22, reflejando la similitud entre Tyr y Phe en términos de obstáculo esterico. Nuestra interpretación se apoya además en el hecho de que en el pH 5,0 se incrementan los valores de k-H para WT y p. His98Tyr (1,44 ± 0,09 h 1 y 1,86 ± 0,05 h − 1, respectivamente) y la diferencia entre las dos especies se hace más pequeña, debido a la protonación del hemo propionatos, lo que resulta en una interacción disminuida del grupo hemo con la proteína. Tabla 2 efecto de la mutación en las propiedades bioquímicas de la tabla de tamaño MBFull

A continuación, investigamos el impacto de la mutación en el estado de oxidación del hierro del hemo, tanto desde un punto de vista termodinámico como cinético. Los MB oxidados y reducidos coexisten en la solución, y la relación de las dos formas se regula termodinámicamente por el potencial de reducción E ° ‘ y de forma Kinética por la autoxidación de la proteína rate17, que a su vez se ve influenciada por el pH, la concentración de oxígeno y temperature23. El proceso de autoxidación se controla kinéticamente en condiciones fisiológicas. Observamos constantes de tasa de autoxidación casi idénticas Kox para WT y p. His98Tyr (ver tabla 2). Además, las características espectrales de las formas de deoxi, Oxi y metmioglobina para el WT y el mutante son idénticas (Fig. 8 complementario). Por el contrario, WT y p. His98Tyr presentan valores de potencial de reducción ligeramente diferentes (E ° ‘). Las investigaciones especelectroquímicas produjeron un E ° ‘ de (+ 0,040 ± 0,005) V vs ella para WT MB, en excelente acuerdo con findings24 anteriores, mientras que el potencial de reducción de la mioglobina p. His98Tyr se desplaza hacia valores más bajos (Fig. 6). E ° ‘ determina la tendencia de la transferencia de electrones desde el centro fe (II) al dioxígeno enlazado ligand25, un paso crítico del proceso de autoxidación que produce el MetMB inactivo. Desde un punto de vista puramente termodinámico, los valores de E ° inferiores favorecerán la formación de MetMB autooxidados.

Fig. 6
Fig. 6

Otra diferencia importante entre el WT y el MB mutante se refiere a la afinidad por el oxígeno molecular. Los estudios de enlace de oxígeno a las desoximioglobinas de WT y mutantes mostraron la formación de los Estados de oxymyglobin (banda Soret a 418 nm y dos bandas distintas en 545 y 580 nm) (Fig. 7). El cálculo de las constantes de velocidad, Kon, de la Unión de O2 de la pendiente de las parcelas lineales de los valores de Kobs versus la concentración de O2 (Fig. 7b) produjo tasas de Unión biomoleculares aparente de (1,16 ± 0,7) × 107 M − 1 s − 1 (WT MB) y (5,6 ± 0,2) × 106 M − 1 s − 1 (p A partir de la intercepción, Koff, de estas parcelas, las constantes de disociación, KD (= Koff/Kon), se calcularon para ser (1,2 ± 1,1) μM y (8,4 ± 2,5) μM, respectivamente (ver tabla 2), demostrando una afinidad reducida del MB mutante para el oxígeno molecular.

Fig. 7
Fig. 7

Para arrojar luz sobre los cambios estructurales y dinámicos causados por la sustitución de his-to-Tyr subyacente a la compleja imagen bioquímica descrita anteriormente, realizamos simulaciones de dinámicas moleculares (MD) tanto de las especies de WT como de las mutantes. El análisis de nuestro muestreo sugiere que la sustitución no conduce a grandes reordenamientos estructurales globales. El pliegue global de la proteína parece mantenerse (Fig. 6), y las dos proteínas presentan patrones de fluctuación casi superimponibles (Nota complementaria 2 e higos suplementarios 9 y 10). Sin embargo, las simulaciones de MD indicaron que el grupo hemo en p. His98Tyr es más solvente expuesto que en la proteína WT. Esto puede explicar el cambio de E ° ‘, que es altamente (aunque no solamente) influenciado por el grado de exposición del hemo a solvent26, 27; Este último también podría contribuir al incremento de KD para la Unión de O2 a p. His98Tyr, debido al entorno más polar resultante de una mayor accesibilidad al agua.

Los estudios iniciales que utilizan un ensayo de células reporteras sugieren que la mioglobina mutante puede dar lugar a niveles elevados de superóxido intracelular. Las células HEK transfectadas con MBP. His98Tyr-EGFP tenían niveles significativamente elevados (1,45-Fold, p = 0,007) de superóxido intracelular en comparación con los transfectadas con MB-EGFP de tipo silvestre (Fig. 7C). Otras investigaciones experimentales de los cambios estructurales y funcionales causados por la sustitución arrojan más luz sobre la alteración de la relación entre la estructura, la dinámica y la función en la variante p. His98Tyr.

Discusión

La mioglobina pertenece a la superfamilia globina. Las mutaciones en la hemoglobina han sido reconocidas durante mucho tiempo y resultan en hemoglobinopathies28. Otras dos proteínas globinas (citoglobina y neuroglobina) aún no se han asociado a disease29. Nuestros hallazgos nos permiten describir el primer trastorno causado por una mutación en MB. Proponemos que el trastorno se denomine Mioglobinopatía. La familia 3, descrita por primera vez por Edstrom et al. 30, 31in 1980, se convirtió en un clásico de la literatura de la enfermedad muscular, pero su causa permaneció sin resolver hasta ahora. La mioglobinopatía tiene un fenotipo clínico reconocible, caracterizado por el inicio de la enfermedad durante la cuarta o quinta década de vida, que se manifiesta con debilidad proximal en las extremidades inferiores y los músculos axiales, progresando para involucrar a los músculos proximales y distales de todas las extremidades con debilidad generalizada posterior. Aunque inicialmente se describió como un distal myopathy30 nuestro estudio demuestra que todos los pacientes exhiben debilidad proximal como el síntoma inicial. La insuficiencia respiratoria es una complicación frecuente y es la causa de muerte en la mayoría de los pacientes. De hecho, la mayoría de los pacientes avanzados necesitarán apoyo respiratorio no invasivo. La miocardiopatía se demostró en menos de la mitad de los pacientes. No se sabe si la afectación miocárdica es una característica inconstante de la enfermedad, o se mantiene subclínica durante mucho tiempo. En apoyo de esta última hipótesis, el examen post mortem del tejido cardíaco en dos individuos que no manifestaron síntomas de insuficiencia cardíaca mostraron un gran número de cuerpos sarcoplasmáticos.

La combinación de debilidad proximal y axial y la insuficiencia respiratoria comparten algunas similitudes con el fenotipo de pacientes que sufren de la enfermedad de Pompe de aparición tardía. Sin embargo, la miocardiopatía no suele ser una característica de la enfermedad de Pompe de aparición tardía; por otra parte, afectación muscular distal como revelado por el examen clínico y estudios de imagen muscular no se produce en las enfermedades de Pompe de inicio tardío hasta muy tarde en el transcurso de la illness32.

Los cuerpos sarcoplasmáticos son el sello patológico de la enfermedad y son la principal ayuda para el diagnóstico. Tienen algunas similitudes con lipofuscin33 y también con las inclusiones densas globulares encontradas en Pompe disease33, 34 pero son mucho más densas y homogéneas, y por lo general carecen de las gotas de lípidos vacuolares observadas en estas dos condiciones. También son muy reminiscencias de las inclusiones encontradas en los músculos esqueléticos de pacientes con deficiencia crónica de vitamina E, que se sabe que son el resultado de la oxidación lipídica como consecuencia de la stress35 oxidativa.

MB lleva a cabo sus tareas fisiológicas gracias a un equilibrio extremadamente delicado de la Unión eficiente del oxígeno, resistencia a la autoxidación, y afinidad alta del hemo. La interacción completa entre las propiedades moleculares afectadas por la mutación patógena es obviamente compleja. Sin embargo, se desprende de nuestra caracterización bioquímica que algunas propiedades clave se alteran sobre la mutación, cada una con posibles repercusiones a nivel fisiológico. El aumento de k-H haría que el mutante más propenso a la pérdida de hemo, como se ha visto anteriormente con la variante del cachalote myoglobin21, y esto podría contribuir a la formación de los agregados lipídicos y/o proteicos encontrados en el músculo de los pacientes debido a la generación de ROS por heme36 gratis. En apoyo de esta hipótesis, hemos mostrado experimentalmente, a través de un ensayo de células reporteras, que la mioglobina mutante parece estar asociada con niveles elevados de superóxido intracelular. Como consecuencia, aunque la mioglobina se expresa en miofibras oxidativas, el impacto de la mutación puede reflejarse en ambos tipos de miofibras. El E ° ‘ Shift puede impactar en el papel de la mioglobina como un regulador de las vías redox en el músculo, por ejemplo desequilibrando los mecanismos dependientes de redox de NO formation37, 38, 39, mientras que el KD más alto de la MB mutante para el O2 podría afectar la capacidad de MB para actuar como una especie de almacenamiento de oxígeno.

Hasta la fecha, todos los casos de mioglobinopatía han sido causados por la misma variante de sentido erróneo c. 292C > T, (p. His98Tyr) en MB, lo que sugiere que esta posición puede ser un punto de acceso mutacional. Demostramos que la variante de mal sentido c. 292c > T, (p. His98Tyr) está asociada con la Unión de oxígeno alterada y una mayor tendencia a la pérdida de hemo. Queda por ver si otras variantes en MB resultan en la misma enfermedad.

Métodos

Pacientes

Los 14 pacientes descritos en este estudio constituyen una cohorte clínicamente y patológicamente homogénea de pacientes adultos pertenecientes a seis familias no relacionadas (F1 – F6), (Fig. 1), originarias de España (2), Suecia (1), Francia (2) y Países Bajos (1). Las familias se identificaron principalmente por sus rasgos altamente característicos en las biopsias musculares. Las características clínicas y patológicas de la familia sueca han sido described34, 35 y el paciente holandés fue descrito brevemente en un taller report40.

El estudio fue aprobado por los comités de ética de las instituciones participantes: IDIBELL-Hospital de Bellvitge, Karolinska Institutet, Universidad de Australia occidental, Institut de Myologie, GHU Pitié-Salpêtrière, Hospices Civils de Lyon, Universidad Hospitales Leuven y Henri Mondor Universidad Hospital de muestras de la colección se realizó con el consentimiento informado por escrito de los pacientes de acuerdo con la declaración de Helsinki.

La biopsia muscular

Se realizó una biopsia muscular para al menos un paciente afectado por familia después del consentimiento informado por escrito (tabla complementaria 1). Además, las muestras de músculo post mortem, esqueléticos y de diafragma se obtuvieron de individuos F1, II: 7 y el músculo post mortem cardíaco y esquelético se obtuvo de F3: III: 5 individual. Las muestras fueron procesadas para el análisis histquímico de rutina y para la actividad de la fosfatasa ácida, y la mancha azul prusiana de Perls y el rojo Alizarin para la detección de hierro y calcio, respectivamente. Se realizó un análisis inmunohistoquímico para mioglobina, ubiquitina, P62 y LAMP1. Las secciones Cryostat, de 8 μm de espesor, fueron incubadas con 1% de peróxido de hidrógeno en 1 × PBS (tampón de fosfato salino) durante 5 min con el fin de bloquear la peroxidasa endógena. Luego, las reacciones de Unión inespecíficas fueron bloqueadas con un 10% (cabra) o 3% (caballo) suero normal en 1 × PBS para 2H, seguido de la incubación del anticuerpo primario correspondiente diluido en 1 × PBS con 3% (cabra) o 1% (caballo) suero normal a 4 ° c durante la noche. Anti-mioglobina monoclonal de ratón (Novus Biologicals), anti-LAMP1 (Santa Cruz Biotechnology, H-228: SC-5570), conejo policlonales anti-ubiquitin (Dako, z-458), y anticuerpo policlonales de conejillo de Indias contra el C-terminal de P62 (Progen, GP62-C) fueron utilizados en un dilución de 1:50, 1:100, 1:100 y 1:100, respectivamente. Después del lavado, las secciones se procesaron con el sistema de detección de IHC de etiqueta de enlace Super Sensitive (BioGenex) siguiendo las instrucciones del fabricante. Como los cuerpos sarcoplásmicos son marrones y la diaminobenzidina (DAB) las inmunoreacciones aparecen marrones, las inmunoreacciones se visualizaron como un precipitado azul oscuro usando NH4NiSO4 diluido en tampón de fosfato con 0,03% DAB, 0,04% NH4Cl, y 0,001% de hidrógeno peroxide41. Las secciones fueron visualizadas con un microscopio Olympus BX43. Las secciones no teñidas también se examinaron con un microscopio confocal Leica TCS-SL en una amplia gama de líneas de excitación láser visibles. Se corrigió una pequeña muestra de tejido de biopsia en un 2% de glutaraldehído, con un sufijo de tetroóxido de osmio al 1% y se incrustó en Araldite. Las secciones ultrafinas se teñían con acetato de uranil y citrato de plomo, vistos con un microscopio electrónico JEOL 1011 y fotografías tomadas con una cámara Gatan 782.

La genética molecular — las dos familias españolas

La captura dirigida y la secuenciación de próxima generación (ProtonTM, tecnologías de la vida) de 336 genes, incluidos 254 genes de enfermedades neuromusculares enumerados en la tabla génica de trastornos neuromusculares a finales del 2012 de diciembre (www.musclegenetable.fr), se realizaron en probands de las familias F1 y F2. El enriquecimiento exoma se realizó en el ADN de la popositus (usando un kit ampliseq Whole exome, thermofisher scientific). En Resumen, un total de 100 ng de ADN se amplificó en 12 grupos de PCR separados, cada uno conteniendo ~ 25.000 pares de imprimación bajo las siguientes condiciones: 99 ° c durante 2 min seguido de 10 ciclos de 99 ° c para 15 s y 60 ° c durante 16 min. Después de la amplificación, las reacciones individuales fueron agrupadas y digeridos utilizando la enzima FuPa suministrada que degrada los cebadores de PCR. A continuación, los adaptadores de secuenciación con código de barras estaban ligados y la biblioteca se purificó con perlas de AMPure (Beckman Coulter) y se amplificó durante cinco ciclos utilizando la polimerasa de alta fidelidad de platino. La biblioteca amplificada final fue purificada de nuevo utilizando perlas AMPure y analizada en un 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies). Las bibliotecas se diluyeron a 18 – 26 pM. Apego a las partículas de la esfera de iones se hizo con el kit de ion Proton plantilla 200 v3. La secuenciación se realizó en chips de secuenciación P1 (520 flujos) usando un secuenciador ion Proton y un kit de secuenciación ion 200 v3. Después de la agrupación, dos muestras fueron secuenciadas en un chip. Después de la secuenciación, para eliminar las bases de baja calidad del extremo 3 ‘, se recortó la lectura. Las lecturas se asignaron a la secuencia de referencia del genoma (Hg19) usando TMap (torrent Suite 4,2). El llamador de torrent Variant se usó para llamar a variantes con ajustes personalizados optimizados para exome. Ion Reporter 4,0 se usó para anotar los datos. El filtrado de variantes se realizó con ANNOVAR contra tres bases de datos: ENCODE código de GENECODE v. 19, 1000genomes (umbral > 0,5%), dbSNP138 y también contra una lista de variants42 comunes de la casa. Los datos filtrados fueron interrogados para las variantes en un conjunto de genes que fueron más altamente enriquecidos (> 1000-Fold) en muestras de músculo esquelético dentro de la FANTOM5 (anotación funcional del genoma de mamíferos) datos set8. Usando el Atlas de expresión de nivel de promotor FANTOM5, generamos una lista clasificada de genes enriquecidos con músculo esquelético. El archivo de origen con la expresión relativa calculada previamente se descargó de http://fantom.gsc.riken.jp/5/tet/data/hg19.cage_peak_phase1and2combined_rel_expr.txt.gz. Identificamos al promotor por cada gen con la expresión más enriquecida en muestras de músculo esquelético 76 y lo comparamos con la expresión mediana en toda la colección FANTOM5 [log10 (expresión máxima en cualquier muestra de músculo esquelético + 1) — log10 (mediana expresión en la colección FANTOM5 + 1)]. Un promotor de 82 genes de codificación proteica anotadas fue identificado mostrando una expresión enriquecida de 1000 veces en el músculo esquelético. Treinta y uno de estos genes se había asociado previamente con una enfermedad genética del músculo en los seres humanos. Los 51 genes que no se habían asociado previamente con la enfermedad muscular humana priorizamos como genes de la miopatía candidata.

Análisis de vinculación de la familia sueca en todo el genoma: familia 3

El análisis de varillaje en todo el genoma se realizó utilizando genotipos de marcadores de microsatélites 550. Los errores de genotipo se verifican y eliminan antes de los análisis utilizando PedCheck43 GENEHUNTER v. 2,144 como se utiliza para el análisis de vinculación paramétrico y no paramétrico. Se realizó un análisis paramétrico de la vinculación asumiendo un modelo autosómico dominante con una penetrancia de 0,999 para heterocigotos, frecuencia alelo de la enfermedad de 0,001, y tasa de fenocopia de 0,001. Las puntuaciones LOD se calcularon bajo el mismo modelo dominante. Se realizaron análisis de puntos múltiples y de un solo punto. Las posiciones de los loci marcadores se basaron en los mapas genéticos humanos publicados (Centro Nacional de información biotecnológica).

Secuenciación de objetivos en la familia sueca

La captura y secuenciación específicas incluyeron > 400 genes que rodeaban la puntuación máxima de LOD multipunto. El enriquecimiento para la región de secuenciación de destino se obtuvo mediante el uso de una biblioteca de desarrolladores de NimbleGen SeqCap EZ diseñada a medida (Roche NimbleGen, Inc. Madison, WI 53719 EE.UU.). Se seleccionaron ocho muestras, dos controles sanos y seis pacientes de la familia sueca, F3, para la secuenciación dirigida. La secuenciación se realizó en SciLifeLab Stockholm, Suecia. Todas las muestras produjeron el número esperado de lecturas de secuenciación. Cada biblioteca de ADN se preparó a partir de 3 μg del ADN genómico agrupado. El ADN fue cortado a 300 BP usando un instrumento Covaris S2 y enriquecido usando el kit NimbleGen SeqCap de diseño personalizado. La agrupación en clústeres se realizó en un sistema de generación de clústeres de cBot mediante un kit de generación de clúster de lectura de extremo emparejado HiSeq de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron secuenciadas en un Illumina HiSeq 2000 como las lecturas de final emparejado a 100 BP. Las ejecuciones de secuenciación se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La conversión de base se realizó utilizando el OLB v 1.9 de Illumina.

La secuenciación de Sanger

La variante MB c. 292C > T (p. His98Tyr) se identificó en las familias F1 a F3 a través de NGS. La presencia de la variante en estas tres familias fue confirmada por Sanger. Las familias F4, F5 y F6 se proyectaron para detectar mutaciones en MB utilizando la secuenciación de Sanger. Se realizaron estudios de segregación en todas las familias, incluyendo muestras de todos los parientes afectados y no afectados, utilizando la secuenciación de Sanger. Los imprimadores MB se incluyen en los métodos complementarios 1.

En las predicciones de silico

Los predictores de patogenicidad in silico utilizados fueron: MutationAssessor45, MutationTaster46, PolyPhen-247, Provean48 y SIFT49.

El análisis de haplotipo

Para probar posibles efectos fundadores, estudiamos ocho marcadores de microsatélites informativos (D22S685, D22S691, D22S1152, D22S1265, (MB), D22S277, D22S683, D22S692, IL2RB) que abarcan 3 MB alrededor de MB utilizando la reacción en cadena de polimerasa múltiplex con imprimadores etiquetados y Análisis de fragmentos. El software GeneMapper fue utilizado para el análisis de fragmentos. Los imprimadores utilizados en el análisis haplotipo se incluyen en los métodos complementarios 2.

La microscopía electrónica correlativa y las imágenes NanoSIMS

Para NanoSIMS (espectrometría de masas de iones secundarios Nanoscale), se montaron secciones de 500 nm de muestras musculares incrustadas de resina de individuos F1 II: 5, y II: 7 y F2 II: 2 en cubreobjetos recubiertos de platino, y luego se transfirieron a un electrón de escaneo FEI verios microscopio (SEM) para el electrón retrodispersado (BSE) imaging50. Se utilizó un haz de electrones de 1 – 2 kV con corriente de ~ 100pA para la imagen de la EEB. Las secciones fueron entonces recubiertas con 5 Nm de platino por un SC 7640 Polaron tartamudo va Coater, y transferidos a la nanosims 50l (Cameca, Francia) para el análisis químico. Las mismas áreas imágenes por SEM fueron analizadas por los nanosims para la distribución química. Un 16 keV CS + Haz primario se utiliza para detectar 31P, 32S –, y 56Fe16O.

Para fines comparativos, además de las muestras de mioglobinopatía, realizamos el análisis de NanoSIMS en una muestra de un paciente con enfermedad de Pompe que contiene inclusiones de electrones densos, dos muestras que muestran abundante lipofuscina y dos muestras musculares de pacientes afectados por miopatías distales con vacuolas con bordes.

Fourier transforma la microscopía infrarroja

se obtuvieron secciones musculares de criostato de 10 μm de grosor de individuos F1, II: 5 y II: 7, F2, II: 2, F3, III: 5, II: 15 y IV: 6 y se depositaron en CaF2windows y se les permitió secar. Las muestras se mantuvieron en condiciones de vacío antes del análisis de espectroscopía infrarroja. los experimentos μFTIR se realizaron en la línea de haz MIRAS en el sincrotrón ALBA, España utilizando un microscopio Hyperion 3000 acoplado a un espectrómetro Vertex 80 (Brucker) equipado con un objetivo de magnificación de 36x. El rango de medición fue de 900 − 4000 cm − 1 y la recolección de espectros se realizó en modo de transmisión a una resolución espectral de 4 cm − 1, dimensiones de apertura de 10 μm × 10 μm mediante un detector de Telluride de mercurio (MCT). Por cada espectro 128 escaneos fueron co-agregados. Los espectros de fondo fueron recogidos de un área limpia de cada ventana de CaF2. Los datos de FTIR se analizaron utilizando OPUS 7,5 (Brucker) y Origin 9,1. Se eliminaron los espectros que mostraban una fuerte dispersión Mie y se aplicó la segunda derivación de los espectros con el fin de eliminar la línea de base y mejorar la resolución de las diferentes bandas utilizando un algoritmo Savitzky-Golay con un filtro de 15 puntos y un orden Polinómico de dos. Las asignaciones de las bandas infrarrojas están bien establecidas para las proteínas y los lípidos y se muestran en la Fig. 5C. Se calculó la derivada de cada espectro FTIR y las proporciones para la oxidación lipídica (1741 cm − 1/2925 cm − 1, CO/− CH2) y la proporción de proteína lipídica (2925 cm − 1/1654 cm − 1 amida I/− CH2) calculated51.

Expresión y purificación de WT recombinante y MB mutante

los plásmidos pET-19b con WT humano, p. His98Tyr o p. His65Tyr/Val69Phe myoglobina cDNA (este último para ser utilizado para estudios cinéticos de pérdida de hemo, ver abajo) clonados en ellos fueron comprados (GenScript USA Inc.) y luego transformados en Escherichia coli BL21 (DE3) para el producción de mioglobinas de fusión con la etiqueta N-terminally. El medio Luria-Bertani complementado con ampicilina (100 μg/ml) fue inoculado con un cultivo nocturno recién preparado (con una relación de dilución de 1:100). La cultura se cultivó a 37 ° c bajo agitación (220 rpm) hasta que se alcanzó OD600 = 0,6. La temperatura y la velocidad del agitador se redujeron a 20 ° c y 100 rpm y se añadió haemin a una concentración final de 15 μg/mL. Después de 30 min, se añadió Isopropil-β-d-thiogalactopyranoside a una concentración final de 0,5 mM. Tenga en cuenta que p. His65Tyr/Val69Phe para los experimentos de la tasa de pérdida de haemin se cultivó utilizando el mismo procedimiento, pero no se agregó haemin. Para asegurarse de que el doble mutante estaba en la forma APO, 3,5 mg de proteína a pH 2,5 fueron extraídos utilizando un volumen igual de 2-butanona, sacudiendo tres veces durante 5 min y luego incubando la mezcla durante 10 min a 4 ° c 20. La fase acuosa se diyzó a 4 ° c contra 1 l de agua y luego contra 1 l de 0,2 tampón de Mpfosfato pH 7 o 0,2 M tampón de acetato pH 5. Después de 12 h, el cultivo fue centrifugado, resuspendido en tampón de fosfato de 50 mM, NaCl de 150 mM, y 20 mM de imidazol (pH 7,5), liofilizado por sonicación y clarificado por centrifugación. Las proteínas fueron purificadas por cromatografía de afinidad (columnas de crudo HisTrap FF (GE Healthcare) conectadas a un sistema cromatográfico AKTA Prime (Amersham Pharmacia Biotech) y posteriormente por cromatografía de filtración de gel (HiLoad 16/60 superdex 75 Prep grado (Amersham Biosciences). La pureza de las fracciones se comprobó mediante electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato sódico de dodecil y espectroscopía UV-VIS.

La prueba de agregación de mioglobina de WT y His98Tyr

WT MB y la variante His98Tyr MB fueron incubados en 10 tampón de mMphosphate a pH 7,4 a 37 ° c y 200 rpm agitados durante 1 semana. En diferentes momentos, se tomaron alícuas para las mediciones de fluorescencia y espectroscopía infrarroja de ThT. Para la detección de fluorescencia de fibril, se añadió thioflavin T (ThT) (SIGMA-ALDRICH), un tinte de fluorescencia específico de las fibrillas, a la solución. En total, se prepararon soluciones de material ThT de 8 mM en tampón de fosfato de 10 mM en tampón de pH 7,4 y se filtraron a través de una unidad de filtro accionada por jeringa de 0,45 μm (Millipore). La concentración final de ThT en la cubeta de fluorescencia fue de 35 μM. Las longitudes de onda de excitación y emisión se fijan en 450 y 490 nm, respectivamente, utilizando un fluorómetro PTI. Temperatura fue de 37 ° c. Para los espectros infrarrojos, se depositaron 3 μL de las diferentes muestras en CaF2 Windows y se secaron al vacío. Los espectros infrarrojos se midieron en la línea de haz MIRAS en el sincrotrón ALBA.

Las mediciones electroquímicas

Todos los experimentos espectroelectroquímicos se realizaron en una célula OTTLE casera (Espectroelectroquímica de capa delgada transparente óptica), en una configuración de tres electrodos que consistía en un electrodo de trabajo de minirejilla de oro (Buckbee-Mears, Chicago, IL), un electrodo de microReferencia Ag/AgCl/3M KCl (373/SSG/6, electroquímica de Amel, Milano, Italia) y un alambre de platino como electrodo de mostrador. Las potencialidades se aplicaron a través de la célula de OTTLE con un Amel Model 2053 Potenciostat/galvanostat. Una temperatura constante fue mantenida por un baño de agua circulante, y la temperatura de la célula OTTLE fue monitoreada con un micro termo-par. Los espectros UV-VIS se registraron utilizando un espectrofotómetro Varian Cary C50. La célula de OTTLE fue lavada con gas de argón para establecer un ambiente libre de oxígeno en la célula. Los experimentos se realizaron a una temperatura constante de 25 ° c, utilizando 600 μL de muestras que contenían 15 μM de proteína en tampón de fosfato de 50 mM (pH 7,0) 20 mMNaCl y Metosulfato de Fenazina de 30 μM. Las parcelas Nernst consistían en al menos cinco puntos y eran invariablemente lineales con una pendiente consistente con un proceso de reducción de un electrón. Los voltammogramas de onda cuadrada se registraron utilizando un mod Potenciostat/Galvanostat. 273A (EG&G PAR, Oak Ridge, USA). Se utilizó un electrodo de disco de grafito, un alambre PT y un electrodo de calomelano saturado (SCE) como electrodo de trabajo, contador y referencia, respectivamente. El contacto eléctrico entre el SCE y la solución de trabajo se logró con un conjunto VYCOR® (PAR). El electrodo de trabajo se limpió antes de cada uso con pulido mecánico con óxido de aluminio de 0,5 μm seguido de 5 minutos en un baño de ultrasonido. La mioglobina se depositó sobre el electrodo mediante fundición a gota de 10 μL de una solución que contenía proteína de 100 μM y tampón de fosfato de 20 mM (pH 7,0). El electrodo fue entonces incubado durante la noche a 4 ° c. El siguiente paso fue lanzar 20 μL de una solución que contenía 10% m/m de gelatina tipo A (Sigma-Aldrich, G1890) y tampón de fosfato de 20 mM (pH 7,0), seguida de incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. El electrodo estaba entonces listo para mediciones electroquímicas. La solución de trabajo era tampón de fosfato de 20 mM (pH 7,0). Los experimentos se realizaron bajo atmósfera de argón a 25 ° c. Los errores asociados a los valores de E ° son las desviaciones estándar calculadas sobre al menos tres conjuntos independientes de mediciones para cada especie.

Medición de las tasas de pérdida de haemin para WT y p. His98Tyr

La cinética de disociación Hemin se investigó de la siguiente manera: supervisamos la disminución con el tiempo (0 – 350 min) de la absorbancia a 410 nm para la transferencia del hemo de holo WT (o p. His98Tyr) MB al doble mutante APO MB p. His65Tyr/Val69Phe20, 21 en a 1:10 relación de concentración. Los cursos de tiempo se han ajustado a una expresión exponencial única en GraphPad Prism 5,0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) para obtener la tasa de disociación de primera orden constante para la pérdida de haemin k-H. Los experimentos se realizaron a 37 ° c en presencia de 0,45 M de sacarosa, en tampón fosfato de 0,2 M a pH 7 o 0,2 M tampón de acetato pH 5. Los espectros UV-VIS se registraron utilizando un espectrofotómetro Varian Cary C50.

El modelado molecular

Para cada proteína, 3 350 NS-Long MD simulaciones se produjeron utilizando la versión 5.0.4 del software GROMACS. La estructura inicial de la mioglobina humana se tomó del archivo PDB 3RGK52. El programa Modeller53, 54, 55, 56 se usó para editar el archivo 3RKG. pdb. La estructura del C-Terminus se tomó del archivo PDB 1MWD57. La estructura del mutante p. His98Tyr se obtuvo mediante modelado de homología utilizando Modeller y tomando el archivo 3RGK como estructura de plantilla. Todas las simulaciones se realizaron en el conjunto reducido. Las estructuras iniciales se relajaron primero en el vacío utilizando el algoritmo de descenso más escarpado, 3000 escalones, y luego se colocan en una caja de dodecaédrico rómbica, llena de TIP3P moléculas de agua. Na + y cl − fueron añadidos para neutralizar la carga total de la proteína y para tener una concentración final de 100 mM. Los sistemas se relajaron con el algoritmo de gradientes conjugados en dos pasos. A continuación, los sistemas se recocido a 300 K, a partir de 50 K, en un 100 PS correr. Los sistemas se equilibraron entonces en tres corridas sucesivas, cada una de 500 PS de largo: (i) un NVT en 300 K58, (II) un NPT en 300 K, 1 bar (III) un NPT en 300 K y 1 bar59. El último cuadro fue utilizado como una estructura inicial para la ejecución de producción de MD en el conjunto NPT, a una temperatura de 300 K y una presión de 1 bar. Todas las longitudes de los bonos fueron restringidas usando el LINCS algorithm60 y se usó un paso de integración de 2,0 FS. La electroestática de largo alcance fue calculada por el Particle Mesh Ewald method61, con un espaciado de rejilla de 0,12 Nm combinado con una interpolación cúbica de cuarto orden y un corte de espacio real de 0,9 Nm. Durante todas las ejecuciones, se usó la fuerza CHARMM27 field62with CMAP correction63. Las tres réplicas para cada sistema se realizaron utilizando la misma estructura inicial, pero cambiando la semilla para el generador aleatorio de las velocidades. La determinación de la superficie accesible del disolvente (SASA), el análisis de las distancias, el análisis de la estructura secundaria, la dinámica esencial (ED), los cálculos de las fluctuaciones de la media cuadrada de la raíz y el análisis de clustering, se realizaron utilizando los paquetes GROMACS correspondientes. Los análisis de la ED se realizaron utilizando los átomos de la columna vertebral de los residuos 1 – 150 tanto para el empalme como para el cálculo de la matriz de covarianza. El procedimiento de clustering se realizó con un corte de 0,11 Nm y el GROMOS method64. Los centroides de los primeros clústeres se utilizaron para la comparación de estructuras. El análisis de ED se utilizó para investigar el espacio conformacional extendido por el WT y la mioglobina mutante p. His98Tyr dentro de la simulación de la dinámica molecular (MD) y visualizar los movimientos principales asociados con cada especie. Para evaluar las diferencias entre los patrones de fluctuación característicos de la mioglobina WT y el mutante p. His98Tyr, las trayectorias equilibradas se vincularon para las dos especies en un único conjunto de dinámicas moleculares (trayectoria concatenada) y se realizó el análisis de dinámicas esenciales. La trayectoria concatenada se proyectó sobre un plano definido por los dos primeros vectores de movimiento, que normalmente se denominan plano esencial. Esto permitió una representación bidimensional del paisaje conformacional explorado durante las simulaciones de MD, y para el cálculo del correspondiente paisaje de energía libre.

La Unión de oxígeno a la mioglobina humana de tipo silvestre y la variante His98Tyr

El enlace de oxígeno (O2) resuelto con el tiempo para la mioglobina humana de tipo silvestre y la variante His98Tyr fue monitoreado por espectroscopía de flujo detenido en el modo de mezcla convencional. El aparato de flujo detenido (modelo SX 18MV, fotofísica aplicada) estaba equipado con un detector de matriz de diodos y una célula de cuarzo óptico con una longitud de trayecto de 10 mm (volumen: 20 μL). El tiempo más rápido de mezcla fue de 0,68 ms. Todas las mediciones se realizaron a 25 ° c. Con el fin de establecer condiciones de arranque sin O2, todas las soluciones fueron desgasizadas con Argon. El aparato de flujo detenido (todas las jeringas y tubos) fue ampliamente vaciado con tampón sin O2 (tampón de fosfato de 20 mM, pH 7,0; 20 mM NaCl). La concentración de tipo salvaje MB y de la variante en la célula fue de 1 μM. Antes de las mediciones, las soluciones de proteína sin gas de O2 desgasizadas se redujeron con ditionita de sodio (concentración final 25 μg mL 1). Para probar la Unión al oxígeno, el buffer sin O2 se vació con O2 para diferentes intervalos de tiempo y el O2concentration se determinó usando un electrodo termostatado (25 ° c) de tipo Clark (Oxygraph Plus; Hansatech Instruments, Norfolk, Reino Unido). El electrodo se equilibró a 100% de saturación de O2 por burbujeo de O2 a través del buffer y por 0% de saturación por burbujeo con N2 hasta que las respectivas mesetas fueron alcanzadas para derivar un offset y un factor de calibración. Se realizaron experimentos en tampón de fosfato de 20 mM, pH 7,0, complementado con NaCl de 20 mM. La Unión al dioxigeno se determinó controlando el aumento de absorbancia a 418 nm. Las constantes de la tasa de segundo orden aparente, Kon, se obtuvieron de la pendiente de una parcela de valores de Kobs (derivado de un ajuste exponencial simple de los respectivos seguimientos de tiempo a 418 nm) frente a la concentración de dioxígeno; Koff se derivó de la intercepción de esta trama.

Evaluación de superóxido celular

Las células HEK293FT (p15-20) (Invitrogen) fueron sembradas en la pre-recubiertos con Matrigel (Corning) en placas de cultivo de tejido de 12 pozo. Las células se transfectadas con los plásmidos de expresión pcdna 3.1 que contienen la longitud completa humana salvaje (mbwt) o c. 292c > T MB (MBP. His98Tyr) cDNA fusionado con una etiqueta EGFP (GenScript). Las transfecciones se realizaron utilizando 1 μg de ADN y Lipofectamina® 3000 (thermofisher) según las instrucciones del fabricante. Los experimentos se realizaron entre 48 y 72 horas después de la transfección y se realizaron en tres experimentos independientes. Los plásmidos están disponibles bajo petición. La generación de superóxido basal fue de assessed65 en células individuales que expresaban MBWT y MBp. His98Tyr (según lo indicado por la positividad de EGFP) utilizando el indicador fluorescente dihydroethidium (DHE, 5 μM, 515 – 560 nm ex Filter, 590 Long Pass EM) a 37 ° c. La señal fluorescente DHE se midió en una cámara digital orca de Hamamatsu unida a un microscopio Nikon TE2000-U invertido. Las imágenes fluorescentes se tomaron a intervalos de 1 minuto con una exposición de 200 ms. Metamorph 6,3 se utilizó para cuantificar la señal trazando manualmente las células individuales. Una región equivalente que no contiene celdas se usó como fondo y se restó. La fluorescencia DHE para cada célula se registró como la pendiente de la señal medida en el transcurso de 20 min, normalizada a la señal fluorescente grabada a 1 min.

Disponibilidad de datos

Los datos de origen subyacentes figs. 5, 6 y 7 se proporcionan en el archivo de datos de origen. La nueva variante aquí reportada ha sido depositada en ClinVar, número de accesión: SCV000882438. Los consentimientos de los pacientes no se obtuvieron para la deposición pública de datos de secuenciación, pero estos están disponibles previa solicitud razonable. Cualquier dato adicional que apoye los hallazgos de este estudio está disponible del autor correspondiente, previa solicitud razonable.

Información adicional

Nota del editor: Springer Nature sigue siendo neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Referencias

  1. 1. Ordway, G. A. & Garry, d. j. mioglobina: una Hemoproteína esencial en el músculo estriado. J. exp. Biol. 207, 3441 – 3446 (2004).
  2. 2. Wittenberg, j. b. & Wittenberg, B. A. reevaluación de la función de mioglobina. J. exp. Biol. 206, 2011 – 2020 (2003).
  3. 3. kanatous, s. b. & Garry, D.o. J. las estrategias delecionales del gen revelan nuevos roles fisiológicos para la mioglobina en el músculo estriado. Respir. El fisiol. Neurobiol. 51, 151 – 158 (2006).
  4. 4. Flögel, U., Gödecke, A., Klotz, l. o. & Schrader, J. papel de la mioglobina en la defensa antioxidante del corazón. FASEB J. 18, 1156 – 1158 (2004).
  5. 5. Richards, M. P. reacciones redox de mioglobina. Antioxoide. Señal redox. 18, 2342 – 2351 (2013).
  6. 6. Kendrew, j. c. et al. Estructura de mioglobina: una síntesis tridimensional de Fourier a una resolución de 2 Å. Nature 185, 422 – 427 (1960).
  7. 7. blanchetot, A., Price, M. & Jeffreys, A. J. El gen de mioglobina del ratón. Caracterización y comparación de secuencias con otros genes de mioglobina de mamíferos. Eur. J. Biochem. 159, 469 – 474 (1986).
  8. 8. Forrest, A. R. et al. Un Atlas de expresión de mamíferos de nivel promotor. Nature 507, 462 – 470 (2014).
  9. 9. Meeson, A. P. et al. Mecanismos adaptativos que preservan la función cardíaca en ratones sin mioglobina. Circ. Res. 88, 713 – 720 (2001).
  10. 10. godecke, A. et al. La alteración de la mioglobina en ratones induce múltiples mecanismos compensatorios. Proc. Natl acad. Sci. USA 96, 10495 – 10500 (1999).
  11. 11. Giles, g. I. & Jacob, C. especies reactivas de azufre: un concepto emergente en el estrés oxidativo. Biol. Chem. 383, 375 – 388 (2002).
  12. 12. Kasamatsu, S. et al. Señalización redox regulada por el persulfuro de cisteína y la polisulfidación proteica. Moléculas 21, 1721 (2016).
  13. 13. Terman, A. & Kurz, T. hierro lisosomal, quelación de hierro y muerte celular. Antioxoide. Señal redox. 18, 888 – 898 (2013).
  14. 14. Yang, H., Yang, S., Kong, J., dong, A. & Yu, S. obtención de información sobre las estructuras secundarias proteicas en solución acuosa utilizando la espectroscopía IR de la transformada de Fourier. Nat. El protoc. 10, 382 – 396 (2015).
  15. 15. Benseny-Cases, N., Klementieva, O., Cotte, M., Ferrer, I. & Cladera, J. Microspectroscopia (μFTIR) revela la co-localización de la oxidación lipídica y las placas amiloides en el cerebro de la enfermedad de Alzheimer humano. Anal. Chem. 86, 12047 – 12054 (2014).
  16. 16. Benseny-Cases, N., Klementieva, O., Malý, J. & Cladera, J. agregados no fibrilares granulares y toxicidad en la enfermedad de Alzheimer. Curr. Alzheimer. 9, 962 – 971 (2012).
  17. 17. Brantley, r. e., Smerdon, s. j., Wilkinson, A. J., singleton, e. w. & Olson, j. s. El mecanismo de autooxidación de la mioglobina. J. Biol. Chem. 268, 6995 – 7010 (1993).
  18. 18. Livingston, d. j., McLachlan, s. j., la mar, g. n. & Brown, w. d. mioglobina: interacciones del citocromo b5 y el mecanismo cinético de la metmioglobina reductasa. J. Biol. Chem. 260, 15699 – 15707 (1985).
  19. 19. Hagler, L., Coppes, r. l. Jr & Herman, r. h. Metmyoglobina reductasa. Identificación y purificación de una enzima reducida nicotinamida adenina dinucleótida dependiente del corazón bovino que reduce la metmioglobina. J. Biol. Chem. 254, 6505 – 6514 (1979).
  20. 20. Hargrove, m. s. et al. His64 (E7) → la apomioglobina Tyr como reactivo para medir las tasas de disociación de haemin. J. Biol. Chem. 269, 4207 – 4214 (1994).
  21. 21. Hargrove, m. s., Wilkinson, A. J. & Olson, j. s. factores estructurales que rigen la disociación de haemin de la metmioglobina. Biochemistry35, 11300 – 11309 (1996).
  22. 22. Liong, e. c., Dou, Y., Scott, E. E., Olson, j. s. & Phillips, g. n. Jr. Impermeabilización del bolsillo del hemo. Papel de las cadenas laterales proximales del aminoácido en la prevención de la pérdida de haemin de la mioglobina. J. Biol. Chem. 276, 9093 – 9100 (2001).
  23. 23. shikama, K. El mecanismo molecular de la autoxidación para la mioglobina y la hemoglobina: un venerable Puzzle. Chem. Rev. 98, 1357 – 1374 (1998).
  24. 24. Fuller Taylor, J. & Morgan, V. E. potencialidades de reducción de la oxidación de la metmyoglobina-mioglobina. J. Biol. Chem. 144, 15 – 20 (1942).
  25. 25. Arcon, j. p., Rosi, P., Petruk, A. A., Marti, m. d. & Estrin, D. A. mecanismo molecular de la autoxidación de mioglobina: información de simulaciones por ordenador. J. phys. Chem. B 119, 1802 – 1813 (2015).
  26. 26. Bortolotti, C. A. et al. La abertura reversible de los canales de agua en el citocromo c modula el potencial de reducción de hierro del hemo. J. am. Chem. Soc. 134, 13670 – 13678 (2012).
  27. 27. Akif Tezcan, F., Winkler, j. r. & Gray, h. b. efectos de ligadura y plegado en potencialidades de reducción de proteínas hemo. J. am. Chem. Soc. 120, 13383 – 13388 (1998).
  28. 28. piel, F. B. La carga global presente y futura de los trastornos hereditarios de la hemoglobina. El hematol. Oncol. Clin. Norte. Soy. 30, 327 – 4 (2016).
  29. 29. Burmester, T. & Hankeln, T. función y evolución de los globins vertebrados. Acta Physiol. (OXF.). 211, 501 – 514 (2014).
  30. 30. Edström, L., Thornell, l. e. & Eriksson, A. Un nuevo tipo de Miopatía distal hereditaria con cuerpos sarcoplásmicos característicos y filamentos intermedios (Skeletin). J. neurol. Sci. 47, 171 – 190 (1980).
  31. 31. engvall, M., Ahlberg, G., Hedberg, B., Edström, L. & Ansved, T. miopatía del cuerpo Sarcoplasmic — una rara Miopatía hereditaria con inclusiones características. Acta neurol. De Scand. 112, 223 – 227 (2005).
  32. 32. schoser, b. g. et al. Enfermedad de almacenamiento de glucógeno de aparición adulta tipo 2: fenotipo clinico-patológico revisitado. El Neuropathol. Appl. Neurobiol. 33, 544 – 559 (2007).
  33. 33. Sohal, r. s. & Brunk, U. T. lipofuscin como un indicador del estrés oxidativo y el envejecimiento. Adv. Exp. Med. Biol. 266, 17 – 26 (1989).
  34. 34. Tsuburaya, r. s. et al. Las inclusiones globulares positivas de fosfatasa ácida son un buen marcador de diagnóstico para dos pacientes con enfermedad de Pompe de aparición adulta que carecen de patología específica de la enfermedad. El neuromuscul. Disord. 22, 389 – 393 (2012).
  35. 35. Neville, H. E., Ringel, s. p., Guggenheim, m. e., Wehling, C. A. & Starcevich, j. m., anormalidades Ultrestructurales e histquímicas del músculo esquelético en pacientes con deficiencia crónica de vitamina E. Neurología 33, 48348 (1983).
  36. 36. Kumar, S. & Bandyopadhyay, U. toxicidad de hemo libre y sus sistemas de desintoxicación en humanos. Toxicol. Lett. 157, 175 – 188 (2005).
  37. 37. Maia, l. b. & Moura, j. j. Cómo la biología maneja el nitrito. Chem. Rev. 114, 5273 – 5357 (2014).
  38. 38. rassaf, T. et al. Función de nitrito reductasa de desoximioglobina: sensor de oxígeno y regulador de la energía cardiaca y la función. Circ. Res. 100, 1749 – 1754 (2007).
  39. 39. Shiva, S. et al. La desoximioglobina es una reductasa de nitrito que genera óxido nítrico y regula la respiración mitocondrial. Circ. Res. 100, 654 – 661 (2007).
  40. 40. Goebel, h. h. & Bönneman, C. G. consorcio de miopatía estructural poco común. 169Th ENMC taller internacional raras Miopatías Estructurales. La neuromusc. Disord 21, 363 – 374 (2011).
  41. 41. janué, A., Olivé, M. & Ferrer, I. estrés oxidativo en las desminopatías y miotilinopatías: un vínculo entre el daño oxidativo y la agregación anormal de proteínas. Pathol cerebral. 17, 377 – 388 (2007).
  42. 42. Ravenscroft, G. et al. Las mutaciones de GPR126 son responsables de la Congenita múltiplex de artrogryposis severa. Soy. J. Hum. Genet. 96, 955 – 961 (2015).
  43. 43. O’Connell, j. r. & Weeks, d. e. PedCheck: un programa para la identificación de incompatibilidades de genotipo en el análisis de la vinculación. Soy. J. Hum. Genet. 63, 259 – 266 (1998).
  44. 44. kruglyak, L., Daly, m. j., Reeve-Daly, m. p. & Lander, E. S. Análisis de vinculación paramétrico y no paramétrico: un enfoque unificado de múltiples puntos. Soy. J. Hum. Genet. 58, 1347 – 1363 (1996).
  45. 45. Grimm, d. g. et al. La evaluación de las herramientas utilizadas para predecir el impacto de las variantes de mal sentido se ve obstaculizada por dos tipos de circularidad. Zumbido. Mutat. 36, 513 – 523 (2015).
  46. 46. Schwarz, j. m., Cooper, d. n., Schuelke, M. & Seelow, D. MutationTaster2: predicción de mutaciones para la edad de secuenciación profunda. Nat. Métodos 11, 361 – 362 (2014).
  47. 47. adzhubei, I., Jordania, d. m. & Sunyaev, S. R. predicen el efecto funcional de las mutaciones humanas de mal sentido utilizando PolyPhen-2. Curr. El protoc. Zumbido. Genet. Capítulo 7, unidad 7. 20 (2013).
  48. 48. Choi, Y. & Chan, a. P. PROVEAN Web Server: una herramienta para predecir el efecto funcional de las sustituciones e InDels de aminoácidos. Bioinformatics 31, 2745 – 2747 (2015).
  49. 49. Flanagan, S. E., patch, a. M. & Ellard, S. uso de SIFT y PolyPhen para predecir las mutaciones de pérdida de función y ganancia de función. Genet. Prueba. Mol. El biomark. 14, 533 – 537 (2010). Erratas en: Genet. Prueba mol. Biomarcadores. 14, 730 (2010).
  50. 50. Jiang, H., Kilburn, m. r., Decelle, J. & musat, N. NanoSIMS imágenes químicas combinadas con microscopía correlativa para el análisis biológico de muestras. Curr. Opin. Biotechnol. 41, 130 – 135 (2016).
  51. 51. vileno, B. et al. Evidencia de peroxidación lipídica y fosforilación de proteínas en las células sobre el estrés oxidativo generado por fullerols. Biophys. Chem. 152, 164 – 169 (2010).
  52. 52. Hubbard, s. r., Hendrickson, w. A., Lambright, d. g. & Boxer, S. G. estructura cristalina de rayos X de un mutante mioglobina humano recombinante a 2,8 A resolución. J. mol. Biol. 213, 215 – 218 (1999).
  53. 53. Webb, B. & sali, A. modelado comparativo de la estructura proteica utilizando Modeller. Curr. El protoc. Bioinformar. 47, 5.6.1 – 5.6.32 (2014).
  54. 54. Martí-Renom, M. A. et al. Modelado comparativo de la estructura proteica de genes y genomas. Annu. El Reverendo Biophys. El BIOMOL. Estructura. 29, 291 – 325 (2000).
  55. 55. sali, A. & Blundell, T. L. modelado comparativo de proteínas por satisfacción de restricciones espaciales. J. mol. Biol. 234, 779 – 815 (1993).
  56. 56. Fiser, A., do, r. k. & sali, A. modelado de bucles en estructuras proteicas. Proteína SCI. 9, 1753 – 1773 (2000).
  57. 57. Krzywda, S. et al. Estabilización de O2 consolidado en mioglobina byvaline68 (E11) a sustitución de asparagina. Bioquímica 37, 15896 – 15907 (1998).
  58. 58. Berendsen, h. j. c., Postma, j. p. m., van Gunsteren, w. f., DiNola, a. & Haak, j. r. dinámicas moleculares con acoplamiento a un baño externo. J. Chem. Phys. 81, 3684 – 3690 (1984).
  59. 59. Hoover, w. g. la dinámica canónica: distribuciones de espacio-fase de equilibrio. Phys. El Reverendo phys. 31, 1695 – 1697 (1985).
  60. 60. Hess, B., Bekker, H., Berendsen, h. j. c. & Fraaije, j. g. e. M. LINCS: un solucionador de restricciones lineales para simulaciones moleculares. J. comput. Chem. 18, 1463 – 1472 (1997).
  61. 61. Darden, T., York, D. & Pedersen, L. malla de partículas Ewald: un método N • log (N) para las sumas Ewald en grandes sistemas. J. Chem. Phys. 98, 10089 – 10092 (1993).
  62. 62. Best, r. b. et al. Optimización del campo de fuerza de proteína de todo átomo de CHARMM aditivo que apunta a un muestreo mejorado de la espina dorsal φ, ȥ y los ángulos diedro ȥ (1) y ȥ (2) de la cadena lateral. J. Chem. Teoría comput. 8, 3257 – 3273 (2012).
  63. 63. MacKerell, A. D. Jr, Feig, M. & Brooks, c. l. 3rd extender el tratamiento de la energía troncal en los campos de la fuerza proteica: limitaciones de la mecánica cuántica de fase gaseosa en la reproducción de distribuciones conformacionales de proteínas en simulaciones de dinámicas moleculares. J. comput. Chem. 25, 1400 – 1415 (2004).
  64. 64. Daura, X. et al. Plegado de péptidos: cuando la simulación cumple con el experimento. De Angew. Chem. Int. Ed. 38, 236 – 240 (1999).
  65. 65. Viola, h. m., Arthur, p. g. & Hool, l. c. la exposición transitoria al peróxido de hidrógeno provoca un aumento en el superóxido derivado de las mitocondrias como resultado de una alteración sostenida en la función del canal Ca2 + de tipo L en ausencia de apoptosis en los miocitos ventriculares. Circ. Res. 100, 1036 – 1044 (2007).

Descargar referencias

Agradecimientos

Agradecemos a los pacientes y a sus familias por su colaboración. Este estudio ha sido financiado por el Instituto de Salud Carlos III a través del proyecto PI14/00738 (cofinanciado por el Fondo Europeo de desarrollo regional. ERDF, una forma de construir Europa) y de una beca de la Fundación Genzyme a MO. Agradecemos al programa CERCA/Generalitat de Catalunya por el apoyo institucional. Los RG, NGL y la ARRF son apoyados por las becas del Consejo Nacional de salud e investigación médica de Australia APP1002147, APP1035955, APP1154524 y subvenciones a proyectos APP1080587 y APP1146321. La ARRF también fue apoyada por una beca de investigación senior de la investigación sobre el cáncer, el viaje de MACA a la conquista del cáncer y una beca del proyecto de descubrimiento del Consejo australiano de investigación (DP160101960). El MC es soportado por el ISCIII (JR15/00042). AWr es miembro de Ragnar Söderberg en medicina (M77/13) y cuenta con el apoyo del Consejo Sueco de investigación (AW (VR2016-02179). AWe es apoyado por el Consejo Sueco de investigación (2016-01082), el Consejo del Condado de Estocolmo (20170022), la Fundación del cerebro sueco (FO2015-0146), y la Fundación Knut & Alice Wallenberg (KAW 2013,0026 y KAW 2014,0293). KGC es apoyado por el KOOR, UZ Leuven, Bélgica. AG está respaldada por el Consejo de investigación KU Leuven (C24/16/045). JK es galardonado con el premio al mérito de investigación de la Royal Society Wolfson. El TS es apoyado por el Consejo del Condado de Estocolmo (20170831), la Fundación Stiftelsen Frimurare y Promobilia. La LH está respaldada por una beca del Consejo de investigación médica y salud nacional de Australia (APP1117366). HV es apoyado por la Fundación Nacional del corazón de Australia beca (101930). el análisis del microscopio μFTIR se realizó en la línea de haz MIRAS en ALBA Synchrotron con la colaboración del personal de ALBA. Agradecemos al profesor Josep García Valero de la Universidad de Barcelona por sus útiles comentarios sobre las características ultraestructurales. Agradecemos a dolores Moreno, Susana Arnedo, Guy Brochier, y Benjamín Torrejón-Escribano por su excelente asistencia técnica y al Departamento audiovisual del Hospital Universitari de Bellvitge por su ayuda con la preparación de las figuras. KCG quiere agradecer a Klara Mallants por su apoyo técnico y al Dr. Sjoerd G. van Duinen (Leiden), y al profesor Joachim Weis (Aquisgrán). La muestra muscular y los datos asociados de la familia 5 se obtuvieron de Cardiobiotec Biobank (CRB-HCL Hospices Civils de Lyon BB-0033-00046).

Información de autor

El autor señala

  1. Estos autores contribuyeron igualmente: Montse Olivé, Martin Engvall, Gianina Ravenscroft.
  2. Estos autores supervisaron conjuntamente esta obra: Anna Wedell, Nigel G. Laing.

Afiliaciones

  1. Unidad de neuropatología, Departamento de patología y unidad neuromuscular, Departamento de Neurología, IDIBELL-Hospital de Bellvitge, Hospitalet de Llobregat, Barcelona, 08907, España
    • Montse Olivé
    • , Noemí Vidal
    •  & Isidre Ferrer
  2. Departamento de medicina molecular y cirugía, laboratorio de Ciencias para la vida, Karolinska Institutet, Estocolmo, SE-17176, Suecia
    • Martin Engvall
    •  & Anna Wedell
  3. Centro de enfermedades metabólicas hereditarias, Hospital Universitario Karolinska, Estocolmo, SE-17177, Suecia
    • Martin Engvall
    • , Anna Wredenberg
    • , Christoph Freyer
    •  & Anna Wedell
  4. Centro de investigación médica, Universidad de Australia occidental, Instituto de investigación médica Harry Perkins, Perth, 6000, WA, Australia
    • Gianina Ravenscroft
    • , Alistair r. r. Forrest
    •  & Nigel G. Laing
  5. Departamento de Neurología e Instituto de Biomedicina de Sevilla, Hospital Universitario Virgen del rocío, Sevilla, 41013, España
    • Macarena Cabrera-Serrano
  6. Departamento de Biociencias y nutrición, laboratorio de ciencia para la vida, Karolinska Institutet, Estocolmo, SE-14157, Suecia
    • Hong Jiao
    •  & Juha Kere
  7. Centro de investigación clínica, Hospital Universitario Karolinska, Huddinge, SE-17177, Suecia
    • Hong Jiao
    •  & Juha Kere
  8. Departamento de Ciencias de la vida, Universidad de Módena y Reggio Emilia, Módena, 41121, Italia
    • Carlo Augusto Bortolotti
    • , Matteo Lambrughi
    • , Marzia Bellei
    •  & Giulia di Rocco
  9. Departamento de ciencias químicas y geológicas, Universidad de Módena y Reggio Emilia, Módena, 41121, Italia
    • Marcello Pignataro
    • , Gianantonio Battistuzzi
    •  & Marco Borsari
  10. Escuela de Ciencias moleculares, la Universidad de Australia occidental, 35 Stirling Highway, Crawley, 6009, WA, Australia
    • Haibo Jiang
  11. ALBA Synchrotron luz fuente, Cerdanyola del Vallès, Barcelona, 08290, España
    • Núria Benseny-Cases
  12. División de bioquímica, Departamento de química, Instituto de biotecnología de Viena, BOKU — Universidad de recursos naturales y Ciencias de la vida, Viena, A-1180, Austria
    • Stefan Hofbauer
    •  & Christian Obinger
  13. Escuela de Ciencias humanas, la Universidad de Australia occidental, Perth, 6000, Australia occidental, Australia
    • Helena M. Viola
    •  & Livia C. Hool
  14. Instituto de investigación cardiaca Victor Chang, Darlinghurst, 2010, NSW, Australia
    • Livia C. Hool
  15. Unitat de biofísica, Departament de bioquímica i de Biologia molecular, Facultat de medicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, 08193, Spain
    • Josep Cladera
  16. Departamento de medicina molecular y cirugía, Karolinska Institutet, y Departamento de genética clínica, Hospital Universitario Karolinska, Solna, Estocolmo, SE-17176, Suecia
    • Kristina Lagerstedt-Robinson
  17. Departamento de salud de la mujer y el niño, Karolinska Institutet, Estocolmo, SE-17177, Suecia
    • Fengqing Xiang
    •  Y Thomas Sejersen
  18. Departamento de bioquímica médica y biofísica, Karolinska Institutet, Estocolmo, SE-17177, Suecia
    • Anna Wredenberg
    • , Christoph Freyer
    •  & Paula Clemente
  19. Departamento de Neurología, hospital son Espasas, Palma de Mallorca, 07120, España
    • Francesc Miralles
  20. Departamento de Neurología, Hospital Verge de la cinta, Tortosa, 43500, España
    • Juan José Baiges
  21. Université Sorbonne, UPMC Univ Paris 06, INSERM; UMRS974, CNRS FRE3617, centro de investigación en miología, GH Pitié-Salpêtrière, 47 Boulevard de l’hôpital, 75013, París, Francia
    • Edoardo Malfatti
    •  & Norma B. Romero
  22. Centre de référence de Patlogie neuromusculaire Paris-Est, Institut de Myologie, GHU Pitié-Salpêtrière, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Paris, 75013, France
    • Edoardo Malfatti
    •  & Norma B. Romero
  23. Centre de Patlogie et Neuropatlogie est, Hospices Civils de Lyon; Université Claude Bernard lyon1, Institut NeuroMyogène CNRS UMR 5310 — INSERM U1217; Institut NeuroMyogène, Villeurbanne, 69677, France
    • Nathalie Streichenberger
  24. Electromyographie — Groupement Hospitalier est, Hospices Civils de Lyon, 69677, France
    • Christophe vial
  25. Departamento de Neurología, University Hospitals Leuven, Leuven, 2333, Bélgica
    • Kristl G. Claeys
  26. KU Leuven — Universidad de Lovaina, laboratorio de enfermedades musculares y neuropatías, Departamento de Neurociencias, Neurología experimental, Lovaina, 2333, Bélgica
    • Kristl G. Claeys
  27. Departamento de Neurología, centro médico de la Universidad de Leiden, Leiden, 2333, Países Bajos
    • Chiara s. m. Straathof
  28. KU Leuven — Universidad de Lovaina, laboratorio de Neuroinmunología, Departamento de Neurociencias, Neurología experimental, Lovaina, 2333, Bélgica
    • Un Goris
  29. Departamento de patología, Hospital Universitario de Amberes, Edegem, 2650, Bélgica
    • Martin Lammens
  30. Laboratorio de Patología neuromuscular, Instituto Born-Bunge, Universidad de Amberes, Wilrijk, 2610, Bélgica
    • Martin Lammens
  31. Departamento de patología, centro médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, 6525, Países Bajos
    • Martin Lammens
  32. Centro de referencia neuromuscular, Hospital Universitario Henri Mondor AP-HP, INSERM U955, equipo 10, biología del sistema neuromuscular, Universidad de East-Paris (UPEC), París, 94010, Francia
    • Guillaume Bassez
  33. Programa de investigación de Neurología molecular, Universidad de Helsinki y Folkhälsan Institute of Genetics, Helsinki, 00014, Finlandia
    • Juha Kere
  34. Escuela de biociencias básicas y médicas, King’s College London, London, WC2R2LS, UK
    • Juha Kere
  35. Centro de investigación neuromuscular, Hospital Universitario de Tampere, Universidad de Tampere, Tampere, 33521, Finlandia
    • Bjarne UDD
  36. Instituto genético Folkhälsan, Universidad de Helsinki, Helsinki, 00250, Finlandia
    • Bjarne UDD
  37. Departamento de Neurología, hospital central Vasa, Vasa, centro de investigación neuromuscular de Finlandia, Hospital Universitario de Tampere, Universidad de Tampere, Tampere, 65100, Finlandia
    • Bjarne UDD
  38. Departamento de patología y terapéutica experimental, Universidad de Barcelona, CIBERNEDHospitalet de LLobregat, Barcelona, 08907, España
    • Isidre Ferrer
  39. Centro de medicina molecular, Karolinska Institutet, Stockolm, 17177, Suecia
    • Lars Edström

Contribuciones

MODUS OPERANDI, FORENSE, A.W. y N.G.L. diseñó y supervisó el estudio. Modus operandi, G.R., M.C.-S., HoJ, C.A.B., MP, M.L., HaJ, N.B.-C., S.H., C.O., G.B., MBe, MBo, G.D.R., H.V., L.H., J.C., K.L.-R., F.X., C.F., P.C. y T.S. realizado experimentos. Modus operandi, E.M., G.R., M.C.-S., C.A.B., N.B.-C., S.H., C.O., H.V., L.H. F.X., HoJ, HaJ, A.R.R.F., N.V., I.F., A.W. y N.G.L. datos analizados. MODUS OPERANDI, FORENSE, M.C.-S., F.M., J.J.B., E.M., N.B.R., N.S., C.V., K.G.C., C.S.M.S., A.G., M.L., G.B., J.K., B.U., L.E., A.W. proporcionó muestras y datos clínicos. MODUS OPERANDI, FORENSE, G.R., M.C.-S., H.J., C.A.B., C.O., N.B.-C. y N.G.L. escribió el manuscrito. Todos los autores contribuyeron y aprobaron el manuscrito final.

Los intereses competidores

Los autores no declaran intereses competidores.

Los autores correspondientes

Correspondencia a Montse Olivé o Nigel G. Laing.

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